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3003必赢贵宾会官网在染色体多基因同时编辑技术方面取得新进展
  来源:3003必赢贵宾会官网 发布时间:2017-09-01    供稿部门:微生物代谢工程实验室,代谢工程与合成生物技术实验室

  基因表达精确调控技术是代谢工程和合成生物学的一项关键技术。在代谢途径改造中,通常需要多个基因的协同表达才能达到代谢途径的最优化,从而实现目标化学品的高效生产。在基因表达精确调控方面,目前比较有效的一种策略是使用启动子文库在宿主微生物染色体上对某个特定基因的表达进行调控,从而筛选出最优的表达强度。在此基础上,再使用启动子文库对下一个基因进行调控,经过多步调控,筛选出效果最好的组合。然而,这种策略存在较大的弊端,其只能在单基因维度上进行操作,致使组合文库的容量大大减小,很难筛选出多个基因的最优组合强度。在宿主微生物染色体上对多基因同时进行文库调控是目前代谢工程和合成生物学研究中的一个难点。  

  中科院天津工业生物技术研究所张学礼研究员带领的微生物代谢工程研究团队和毕昌昊研究员带领的代谢工程与合成生物技术研究团队合作,理性设计了CRISPR/Cas9辅助的染色体多基因同时编辑技术(见下图)。该系统由三个质粒组成:质粒IpRBSL-genes)含有待调控的多个基因的调控文库元件及其同源臂;质粒IIpRedCas9)含有Cas9基因及重组酶Red;质粒IIIpgRNA-genes)提供多基因的引导gRNA,引导Cas9在正确的基因上切割。使用这三个质粒,通过两次转化和两次诱导,能在染色体上快速实现多个基因的同时文库调控,操作周期为4天。使用这一策略,对木糖代谢途径中四个基因(xylAB, tktAtalB)的表达同时进行了调控,基因同时编辑的效率达到70%;快速获得了木糖代谢速率提高的多基因编辑菌株,木糖代谢速率提高了3倍。该研究对代谢工程和合成生物学中的途径优化有很大的促进作用。    

  该研究得到国家自然科学基金、国家863计划、中科院重点部署项目及天津市科委的支持。相关研究成果发表在Metabolic Engineeing期刊,中科院3003必赢贵宾会官网副研究员朱欣娜和科研助理赵东东为论文的共同第一作者。 

  文章链接 

  

CRISPR/Cas9多基因编辑系统 

a)基于M1-93人工启动子设计RBS库,下划线显示RBS区域。红色表示用于构建供体DNA质粒对引物接头(b)供体DNA质粒RBS库构建。使用pHomo-genesDNA为模板扩增出三个含有RBS库的基因片段,用Golden-gate技术组装。(c)代谢途径目标基因的调控过程。共转化Cas9质粒和供体DNA质粒,在阿拉伯糖的诱导下,供体DNA发生同源重组;再转化gRNA质粒,诱导Cas9切割非同源重组菌株,实现代谢途径多基因调控。(d)代谢途径多基因编辑步骤。 

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